含黄芪制剂中皂苷类化合物的HPLC测定方法的概述(二)

含黄芪制剂中皂苷类化合物的HPLC测定方法的概述(二) 含黄芪制剂中皂苷类化合物的HPLC测定方法的概述

 

三、HPLC法测定含黄芪制剂皂苷类成分的研究动态 

3.1 HPLC法与其它测定方法的比较

黄芪甲苷的含量是评价黄芪及其制剂 质量的重要指标 , 而且许多中成药也以黄芪甲苷作 为该品种的指示成分。但黄芪甲苷在黄芪中含量很 低 , 提取分离比较困难。现将近年来有关黄芪甲苷含量测定方法做了如下比较。

分光光度法：该法主要利用黄芪甲苷与显色剂 发生显色反应。常用显色剂 : 香草醛 - 硫酸、香草 醛 - 冰醋酸等香草醛试剂 (410～1010 %)[23]。此方 法在以往实验中应用较广泛 , 因为该法简便、快速 , 测定的灵敏度和选择性较高。但随着科学技术的发 展 , 该法也暴露出许多弊端。如 : 样品的前处理复 杂 , 要求较高 , 必须经提取分离纯化等处理 (因为 此方法不能自行分离) 以排除对测定黄芪甲苷的干 扰。但中药黄芪及其制剂中成分复杂 , 影响了分离 提纯 ; 同时 , 显色反应的影响因素较多 , 影响了该 法的准确性和稳定性 , 限制了该法的应用。

薄层扫描法：将不同浓度的供试品、对照品、 阴性对照品 , 滴于同一硅胶 G薄层板上,比较黄芪甲苷的斑点, 进行扫描。此方法测定黄芪甲苷含量 稳定 , 重现性好。但层析时室温不宜高于 25 ℃, 空 气湿度也不宜过大,层析过程中常会出现拖尾现象 , 使分离效果不佳。并且层析条件对层析结果影响也 很大 (层析条件如 : (1) 展开温度。 (2) 展开系统 的饱和性。(3) 背景干扰因素等) 。因此要优选层析 条件,使结果有较好的重现性。比较黄芪甲苷的薄层色谱法 (TLC) 分析条件[24~30]。

高效液相色谱法 ( HPLC 法)：近年对黄芪药材及其制剂中黄芪甲苷含量的测定多采用此方法。因为该法兼具分离和分析功能,比TLC分离效果更好,测定结果更精确;并且该法的流动相选择范围 宽,色谱柱可反复使用,逐渐成为一种首选的分离分析方法。此法还具有准确、快速、重现性好、灵敏度高、减少预处理步骤等优点,从而使结果更可靠。HPLC 法现多用光二极管阵列法,近年 逐渐有人采用蒸发光散射检测法[31]。分子的羟基进行苯甲酯化,使最大吸收波长移至230nm处,从而提高了分离选择性和检测灵敏度,也是一种比较好的方法。(3) 高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD法)[31]: 蒸发光-散射检测法的原理是使流动相溶剂喷雾气化,进入加热管后溶剂挥发,而被分析检测的物质颗粒受激光照射产生散射,散射光由光电倍增管收集得到响应,由被分析物质颗粒的数量和大小决定光散射检测器 的响应大小,而不受流动相溶剂的干扰。所以结论就是采用HPLC-ELSD法对黄芪甲苷含量测定,分离度好,重现性好,不需要进行前处理直接进样,回收率高。但检测灵敏度和精确度不如光二极管陈列法。因此这是一种良好的测定方法,宜广泛采用。

3.2 HPLC法测定黄芪制剂的应用实例

 缺血保护性作用

 目前明确黄芪甲苷在心肌损伤、低氧-复氧造心肌损伤、 缺血大鼠等模型中，可缓解肌浆网，并影响肌浆网内Ca-ATP酶，从而调节钙的转运过程，影响心脏功能。通过上调超氧歧化酶-1的水平、干预PI3-K / Akt通路，刺激血管生成和提高缺氧诱导因子α1的积累，最终对心肌缺血、脑缺血模型，甚至是原位肝移植模型造成的缺血再灌注损伤等都具有保护作用。同时对脑 缺血再灌注导致的血脑屏障渗透性增加病变也有改善作用。在对脑损伤引发的神经损伤也有一定的保护作用。 除对缺血模型有保护作用外，黄芪甲苷心肌有保护性作用，如缓解大鼠的心衰。对抗抑制压力过载型心肌肥厚大鼠的肾素-血管紧张素过度激活，逆转左室肥厚。另外，黄芪甲苷可调节高半胱氨酸诱导的急性期内皮功能异常; 对代谢综合症及内皮功能障碍、衰退型疾病等都有保护作用。从基因水平上分析，发现黄芪甲苷对促血管生成、心肌发育、增强心肌功能等基因有上调作用。 

抗氧化作用 

LL Cao等通过研究黄芪甲苷对过氧化氢诱导的肾小球系膜细胞的保护作用，结果发现黄芪甲苷能够降低胞内ROS产生，上调细胞周期蛋白Cyclin D1的表达，从而减轻肾小球系膜细胞的氧化应激损伤。 

抗病毒方面，有报道称黄芪甲苷具有抗乙型肝炎病毒的活性，在人肺腺癌细胞中可抑制腺病毒的复制和诱导细胞凋亡。通过上调干扰素-γ 发挥抗柯萨奇B3 病毒的作用。同时可通过抑制TGF-β1信号通路，诱发心肌细胞的凋亡，缓解由该病毒引发的心肌炎患者心肌细胞成纤维化进程。 

降糖方面，在对3T3-L1脂肪细胞研究中，黄芪皂苷IV可通过诱导TNF-α分泌，降低脂解作用，改善胰岛的耐受作用。此外，它可以作用于肝糖调节酶，从而发挥降糖作用。对肝星胶质细胞以及猪血诱导的肝纤维化等都有保护作用。 

免疫方面，黄芪甲苷对T，B 淋巴细胞增殖、腹腔巨噬细胞功能等都有影响。通过抑制NF-κB 活性以及黏附分子的表达发挥抗炎作用。X Zhou等研究发现黄芪甲苷可通过调节TLR4、NF-κB及TNF-α在病毒性心肌炎中的表达，从而减轻心肌损伤。研究发现黄芪甲苷还可通过上调干扰素发挥抗柯萨奇B3的作用。

其他皂苷单体 ，除黄芪甲苷具有较好的药理活性外，最新报道的，其余齐墩果烷型和环菠萝烷型皂苷也多具有调节淋巴细胞增殖的作用，其中Macrophyllosaponin B和黄芪皂苷VII，两种黄芪皂苷类成分可通过体液免疫、细胞免疫等发挥免疫调节活性。黄芪皂苷 I，II，III 对不同癌细胞显示了不同的细胞毒作用。

因在黄芪制剂中黄芪的活性成分皂苷所占含量较低，在制备HPLC样品时需要对其进行进一步的提取和浓缩，以便更好进行HPLC法测定。其样品处理的原则首要的是将黄芪制剂中的固体颗粒、少量蛋白、色素等成分除去，避免这些物质的存在对皂苷类化合物的测定结果造成干扰。另一方面也可避免堵塞色谱柱元件，影响流动相流速的稳定性和均一性。 

目前常用的黄芪制剂HPLC样品制备方法有沉淀、过滤、离心、脱脂、结晶、洗涤、再溶解等方法。在有些难以处理制备的样品中，单一的制备方法并不能满足需求，通常可以是多种方法的同时利用以达到制备合乎要求的样品液。封士兰等13人在制备黄芪颗粒样品时，先采用溶剂超声法初步提取，然后用有机溶剂萃取分离得到可直接进样的HPLC样品。 

总的来说黄芪制剂HPLC样品制备方法众多，在样品的制备时需要考虑到黄芪制剂的剂型特点，以及需结合HPLC色谱条件选择合适的样品制备方法。

色谱条件的选择和优化是HPLC法测定黄芪皂苷研究的核心问题，也是技术的难点问题。色谱条件的内容主要包括色谱柱类型、流动相组成比例、梯度洗脱程序、柱温控制、检测器等。 

根据需要测定的黄芪皂苷的分子结构，判断其分子极性大小选择合适的色谱柱，对于大多数极性小的黄芪皂苷的检测，通常选择反向柱，对于部分极性大的皂苷成分则可采用正相色谱柱。流动相的组成比例选择也是至关重要的，根据相似相容原理进行合理选择调整，很少使用单一溶剂作为流动相，这样的洗脱效果较差，往往是甲醇、水、乙腈、无机盐等多种溶剂间的不同组合，其组成比例则需要通过实验摸索。对于部分成分复杂难以洗脱的皂苷成分，通常则需采用梯度洗脱程序，梯度洗脱程序并无明确规定和参考，需要结合具体实验样品，通过反复的实验摸索得的最优的条件。柱温的控制也是需要充分考虑皂苷成分自身的溶解度和稳定性进行合适的调整，尽可能的是皂苷成分完全溶解在溶剂中被流动相洗脱检测出来。检测器的选择也是至关重要的，对于多数有紫外吸收的黄芪皂苷，通常可以采用紫外检测器、二极管阵列检测器，对于部分没有吸收的皂苷类成分，则可采用示差折光检测器，目前也得到了普遍的认可。例如中国药科大学的汪红等人采用HPLC-ELSD法成果检测了黄芪及其注射液中黄芪皂苷I、III、IV等成分。 

总之色谱条件的选择和研究是HPLC法测定黄芪皂苷成分含量的最核心的问题，也是研究者们最为重视和着重研究的方向。但是因为黄芪皂苷成分的复杂和多样性，目前对于不同的制剂和成分，其色谱条件不是千篇一律的，需要具体问题具体分析。 

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