浅谈对某一项药物分析技术的认识

浅谈对某一项药物分析技术的认识 浅谈你对某一项生物药物检验技术的认识 ———薄层色谱 【摘要】：薄层色谱法，是指将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药物的鉴别、杂志检查或含量测定的方法。本文介绍了薄层层析法的原理，操作方法，应用优点及其在药物杂质分析、质量控制等方面的应用实例，并指出了此方法的局限性、须待解决的问题。 【关键词】：原理 操作方法 优点 应用实例 局限性 薄层层析法也称薄层色谱法(thin—layer chromatography)，是快速分离和定性分析少量物料的一种非常重要的技术，常用TLC表示。TLC是色谱技术的一种，与经典的分离提纯手段(重结晶、升华、萃取和蒸馏等)相比，薄层色谱法具有微量、快速、分离效率高和灵敏度高等优点。自从五十年代发现以来，薄层层析法在很多方面得到了广泛的应用，如判断有机合成反应进行的程度；合成药物的质量控制及杂质检查；中草药的分离提纯；药物分析及含量测定等。本文介绍了薄层色谱法的原理，并列举出一些实例主要讨论其在中药测定、化合物鉴定等方面的应用。 1、主要类型和原理 通常所说的薄层色谱一般是指吸附薄层色谱，可根据TLC所采用的涂层材料性质的不同，其物理化学原理也有所不同，可分为： 1.1 吸附薄层色谱。采用硅胶、氧化铝等吸附剂铺成薄层，利用吸附剂表面对不同组分吸附能力的差别达到分离的方法。 1.2 分配薄层色谱。由硅胶、纤维素铺成薄层，不同组分在指定的两相中有不同的分配系数。 1.3 离子交换薄层色谱。由含有交换活性基团的纤维素辅成薄层。 1.4 排阻薄层色谱。利用样品中分子大小不同，受阻情况不同加以分离，也称疑胶薄层。 此外，还有利用氢键能力的强弱而分离的聚酰胺薄层色谱等。 2、薄层色谱的用途： 2.1 化合物的定性检验。（通过与已知标准物对比的方法进行未知物的鉴定） 在条件完全一致的情况，纯碎的化合物在薄层色谱中呈现一定的移动距离，称比移值（Rf值），所以利用薄层色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。所以，要获得重现的比移值就比较困难。为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。 2.2 快速分离少量物质。 （几到几十微克，甚至0.01µg） 2.3 跟踪反应进程。在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失，来判断反应是否完成。 2.4 化合物纯度的检验（只出现一个斑点，且无拖尾现象，为纯物质。） 3、实验装置 薄层板在不同的层析缸中展开的方式 4、实验操作步骤： 4.1 吸附剂的选择 薄层色谱的吸附剂最常用的是氧化铝和硅胶。 “硅胶H”—不含粘合剂； “硅胶G”—含煅石膏粘合剂； 其颗粒大小一般为260目以上。颗粒太大，展开剂移动速度快，分离效果不好；反之，颗粒太小，溶剂移动太慢，斑点不集中，效果也不理想。 化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，因而Rf值较小。 酸和碱 > 醇、胺、硫醇 > 酯、醛、酮 > 芳香族化合物 > 卤代物、醚 >烯 > 饱和烃 4.2 薄层板的制备（湿板的制备） 薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。薄层应尽量均匀且厚度要固定。否则，在展开时前沿不齐，色谱结果也不易重复。在烧杯中放入2g硅胶G，加入5—6ml 0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液，调成糊状。将配制好的浆料倾注到清洁干燥的载玻片上，拿在手中轻轻的左右摇晃，使其表面均匀平滑，在室温下晾干后进行活化。 4.3 薄层板的活化 将涂布好的薄层板置于室温凉干后，放在烘箱内加热活化，活化条件根据需要而定。硅胶板一般在烘箱中渐渐升温，维持105—110℃活化30min。氧化铝板在200℃烘4h可得到活性为Ⅱ级的薄板，在150—160℃烘4h可得活性为Ⅲ—Ⅳ级的薄板。活化后的薄层板放在干燥器内保存待用。 4.4 点样 先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，斑点直径一般不超过2mm。若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。若在同一板上点几个样，样点间距离应为1。点样要轻，不可刺破薄层。 4.5 展开 薄层色谱的展开，需要在密闭容器中进行。为使溶剂蒸气迅速达到平衡，可在展开槽内衬一滤纸。在层析缸中加入配好的展开溶剂，使其高度不超过1cm。将点好的薄层板小心放入层析缸中，点样一端朝下，浸入展开剂中。盖好瓶盖，观察展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快在板上标上展开剂前沿位置。晾干，观察斑点位置，计算Rf值。 4.6 显色 被分离物质如果是有色组分，展开后薄层色谱板上即呈现出有色斑点。 如果化合物本身无色，则可用碘蒸气熏的方法显色。还可使用腐蚀性的显色剂如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸等。 对于含有荧光剂的薄层板在紫外光下观察，展开后的有机化合物在亮的荧光背景上呈暗色斑点。 5、应用实例---用薄层层析法分析海藻糖 海藻糖是自然界广泛分布的一种非还原性双糖。其分子结构独特，化学性质稳定。研究表明：某些物种对外界恶劣环境所表现出来的抗逆耐受能力与它们体内的海藻糖有直接关系；外源性的海藻糖同样对生物大分子具有保护作用。海藻糖这些奇妙的生物学特性，使其在医药、食品、化妆品、农业等方面具有广阔的应用前景。海藻糖的开发已成为国际范围的研究热点。目前海藻糖的定性定量分析，主要借助于高教液相色谱(HPLC)．在国内HPLC仪还不普遍的情况下，这一方法的应用往往受到实验室条件的限制，并且对于菌种筛选、培养及提取过程中大量的海藻糖快速定性定量测定工作，完全依赖于HPLC并不是一个高效经济的方法，而用薄层层析法则是十分便利的。然而，海藻糖和蔗糖、麦芽糖等双糖结构相似，某些性质接近，是薄层层析法分析中的一个难题，文献中也很少报道。作者就薄层的制备、展开剂的选择等方面进行了广泛的研究，确立了一种较理想的分离海藻糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖的薄层层析方法。 1 材料和方法 1．1 材料 标准海藻糖为SIGMA级；标准麦芽糖、蔗糖、葡萄糖均为AR级。硅胶分别为；浙江产硅胶H；青岛产硅胶G；上海产硅胶H。 1．2 方法 1．2．1 硅腔板的制备采用湿法制板。调浆剂和硅胶(硅胶和调浆剂)在研钵中混合研磨后，均匀涂布于干净的玻璃板(10 cm×20 cm)上，自然晾干，使用前105℃活化3O min。 1．2．2 点样 将各标准糖配成1﹪ 的溶液，点样量2微升,点样点距离板底1．5 cm,点样斑点直径控制在3～5 mm，样品间距1．5 cm。 1．2．3 展开于各种展开体系中，室温展开。待展开剂前沿走至距板2 cm 时，取出，自然晾干。 1．2．4 显色 用喉头喷雾器将2O﹪的硫酸一甲醇溶液均匀喷至板上，置于105℃烘箱内加热10min，使显色。 2 结果与讨论 2．1 不同硅胶薄板的分离效果 2．1．1实验 实验中采用浙江产硅胶H，青岛产硅胶G，上海产硅胶H用同一种调浆剂(0．05﹪的羧甲基纤维素钠CMC—Na溶液)调浆制板，于同一展开体系中展开，海藻糖和麦芽糖的Rf值见表l。 由表l可以看出，青岛产硅胶G对海藻糖麦芽糖的分离效果最佳。故以后实验均选用青岛产硅胶G作为吸附剂，简称硅胶G。 2．1．2 湿法制板调浆荆的选择 盐溶液代替水制各薄层，能增加糖在固定相中的溶解度，提高薄层的负荷量，且能使糖的斑点集中，改善分离效果。表2为用不同盐溶液作调浆剂制成的薄板在同一展开体系中对糖分离效果的影响。 由表2可看出，制板时不加粘合剂CMC-Na，用O．1 mol／L的磷酸二氢钠调浆制板，对4种糖的分离效果最好。 2．2 不同展开体系对糖的分离效果的影响 选择展开剂是薄层色谱分离成败的关键。对于海藻糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖等难于分离的物质，我们选用多元展开剂。根据展开剂的选择原则，选择了lO种展开体系，各糖的Rf值见表3． 表3 展开体系对糖分膏效果的影响 由表3可看出，展开体系8，9，1O能够十分清晰地将海藻糖与其他几种糖分开。尽管葡萄糖、蔗糖、麦芽糖之间的分离效果不佳，但并不影响对海藻糖的分析。 2．3 对海藻糖测定的灵敏度 在以硅G一磷酸二氢钠(0．1mollL)制备的薄板上点样。海藻糖的点样量从0．6～30 ug，共l0个不同的点样量处理，于正丁醇：吡叮：水(6：4：1)中展开，显色后其糖的斑点清晰度见表4 表4 本文薄层层析条件下对海藻糖测定的灵敏度 3 结 论 根据以上实验结果，建立了一种定性分析海藻糖的薄层层析方法—— 薄层：青岛产硅胶G一磷酸二氢钠；展开体系：正丁醇一吡叮一水(6 ：4：1)；显色剂：2O﹪的硫酸一甲醇溶液。用本方法能够灵敏地检测出上述几种混合糖溶液中含2 ug以上(包括2 ug)的海藻糖。 6、注意事项： ⑴ 载玻片应干净且不被手污染，吸附剂在玻片上应均匀平整。 ⑵ 点样不能戳破薄层板面，各样点间距1—1.5cm，样点直径应不超过2mm。 ⑶ 展开时，不要让展开剂前沿上升至底线。否则，无法确定展开剂上升高度，即无法求得Rf值和准确判断粗产物中各组分在薄层板上的相对位置。 【参考文献】： [1]国家药典委员会.中华人民共和国药典.化学工业出版社，2000二部：附录31 [2] 关烨第等．小量半微量有机化学实验[M]．北京：北京大学出版社，1999：23 [3]何丽一.平面色谱方法及应用[M].北京:化学工业出版社，2000.108-112 [4] 陆涌．薄层扫描法测定银杏叶浸膏中白果内酯的含量．中成药.2002，2(7)：474-476． [5] 卢英强，宣兆艳等. TLC法鉴定皮肤及肌肉组织中的青霉素. 吉林大学学报.2003，29（6）：780－781 [6] 杨敏智，陈国清. TLC法初筛快速鉴别大环内酯类抗生素. 江苏药学与临床研究.2005，13(3)：69-70 [7] 郑妍，杜健. 红霉素C杂质限量的薄层色谱检测方法的改进. 西北药学杂志.2003，18（2）：56－57 [8]张岱州，宋尚龙，梁慧. 乳糖酸克拉霉素胶囊的薄层色谱鉴别. 齐鲁药事.2005，24（4）：214－215 [9]林秀丽，主沉浮等.高效液相色谱法的进展及其在生化医药方面的应用.中国生化药物杂志，1999，20(3):155 [10] 刘杨，何华等.生化药物分析方法的现状与进展.药学进展，2001,25(2):71-75 [11] 郑志伟.双波长薄层扫描法测定尿塞通片中盐酸小檗碱的含量.安徽中医学院学报，2003,22(3):51－52 [12] 库尔班江.高效薄层光密度法测定牛黄解毒丸中大黄素的含量.伊犁师范学院学报，2003,1:98－99 [13] 芦金清，裴学军，吕冀.聚酰胺薄层扫描法测定金菊花中木犀草素含量.湖北中医学院学报，2002, 4(1):27－28 [14] 兰亦清，范友华，卢宁等.白芍中丹皮酚、芍药苷和苯甲酸的反相薄层色谱分析.天然产物研究与开发，2001,13(6):42－44 [15] 张尊听，刘谦光，何晴等.新型薄层色谱内标法测定葛根素含量.分析化学，2002,30(3):327－330 [16] 吴华，董成明，郑荣庆，等.薄层一酸性染料比色法测定马钱子中士的宁和马钱子碱的含量.基层中药杂志，2001,15(4):9－11 [17]戴静，方娜娜.薄层层析一紫外分光光度法测定十全大补中芍药苷含量.天然产物研究与开发，2003,15(3):206－207 [18]张虹，陈振德，柳正良.TLC-HPLC法分析榧属植物叶中的紫杉酸.第二军医大学学报，2003,24(1):106－107

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