含黄芪制剂中皂苷类化合物的HPLC测定方法的概述 (4)(四)

皂甙类物质的含量测定

4.3.1薄层扫描法

（1）取样品(补阳还五汤制剂>[4]清颗粒 ll g,准确称定,加甲醇 60 ml 回流提取 l 小时。滤过,残渣加甲醇 50 ml，回流提取 l 小时,滤过。 合并滤液(或取等量的口服液 20 ml加乙醇使含醇量达 75%,搅拌,放置过夜。过滤沉淀以 75%乙醇洗涤,合并洗涤液滤，合并滤液,回收乙醇并浓缩近干,加甲 醇 80 ml 溶 解 ,加 已 处 理 好 的 中 性 氧 化 铝 柱 (200~300 目 ,60 g>以上。 用 40%甲醇 300 ml 洗脱,收集洗脱液。回收甲醇并 蒸 干 , 残 渣 用 l00 ml 水 使溶解。用 乙 酸 已 酯 处 理 3 次(40,30,20ml>,水层以正丁醇提 取 3 次 (50,40,30 ml>,合 并正丁醇溶液用水洗 涤 2 次 ,每 次 50 ml,弃 取 水 液 ,回收正丁醇,残渣加甲醇溶解,定量转移至 5 ml 量瓶中并稀释至刻度摇匀,作为供试品溶液。

（2）精密取样(归芪合剂>[7]5 ml 用以水饱和的正丁醇萃取 4 次(20,l5,l5,l0 ml>合并萃取液,以 0.5 mol/l 碳酸氢钠洗涤3 次(l0,l0,5 ml>再用水 l0 ml 洗涤,弃去洗液,正丁醇置水浴上蒸干,残渣用 5 ml 水溶解。水溶液加至 Dl0l 型大孔吸附树脂柱(l cm,l0 cm>内,用 50 ml 水洗脱弃去水液,再用 30%的乙醇洗脱弃去 30%乙醇洗脱液,继续用 70%乙醇 30 ml 洗脱。 收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇溶解,移于 2 ml 容量瓶中,以甲醇稀释至刻度,作为供试品溶液。

（3）取样品(黄芪药 材 >[8]粗 粉 5 g,加 l00 ml 甲 醇 经 索氏提取器提取 5 小时,滤过,甲醇液回收至干。用 25%蒸馏水溶解 残 渣 后 , 乙 醚 脱 脂 2 次 , 再 用 水 饱 和 过 的 正 丁 醇 萃 取 4 次(25,25,l5,l0 ml>,合并正丁醇液,挥去溶剂,残留物用甲醇溶解并定容于 5 ml 量瓶中,即得供试品溶液。

（4）测定方法 吸附剂: 硅胶 G; 硅胶 G-0.l%CMC-na;硅胶 G- 水(lI3>0展开剂:氯仿 - 甲醇 - 水 (65;351l0>5 C或 l0 C放置过夜后的下层液[3~8]0醋酸乙酯 - 丁酮 - 甲酸 - 水(5I3ilzl>[7]0显色剂:l0%的硫酸乙醇溶液,l00 C烘约 5 分钟[7];l0%硫酸液[3];l5%硫酸乙醇溶液,l05 C烘约 l0 分钟[5~6]。

扫描波长

双波长锯齿扫描 Rs nm  KR nm

530   700[9]

505   700[4]

520   700[7]

500   700[6]

单波长反射法锯齿扫描 Rmax =400 nm[3]

4.3.2 高效液相色谱法

（1） 取样品黄芪药材粉碎过40目筛置索氏提取器中, 加甲醇 80 ml 回流提取 5 小时,回收甲醇残渣加10 ml 超声溶解后转移至分液漏斗中,以水饱和的正丁醇萃取 4 次, 每次20 ml合并正丁醇萃取液. 用氨试液 40 ml 浓氨水加水配成 100 ml 洗涤 2 次 每次 20 ml 弃去碱水层 将正丁醇在旋转蒸发仪上减压回收至干 用甲醇溶解并定容至5.0 ml 摇匀的供试品溶液.

（2）取样品 黄芪中粉 [12]4 g 精密称定置索氏提取器中 加甲醇 40 ml 冷浸过夜 再加甲醇适量 加热回流 4 小时 提取回收甲醇并浓缩至干 残渣加水 10 ml 微热使溶解加水和的正丁醇振摇提取 4 次每次 40 ml 弃去氨液 正丁醇液蒸干 残渣加水 5 ml 使溶解 放冷通过 D101 大孔吸附树脂柱 1.5 cm>12 cm 以水 50 ml 洗脱 弃去水液再用 40%乙醇 30 ml 洗脱 弃去 40%乙醇洗脱液 继续用 70%乙醇 80 ml洗脱 收集洗脱液蒸干 用甲醇溶解并至 5 ml 量瓶中 加甲醇至刻度 摇匀即得。

（3）测试条件：〈1〉 HPLC 色谱条件 ZOVA-PakC18 3.9 mm>150mm 色谱柱 柱温 室温 流动相 40%甲醇 流速 1.2 ml/min测波长 204 nm 灵敏度 0.05 AUFS[14]

（4）RP-HPLC 色谱条件 Innertsil ODS-2 4.6 mm150 mm 色谱柱 乙腈 - 水 31169 为流动相 流速 0.8ml/min 柱温 35 C 检测波长 203 nm 灵敏度 0.08 AUF。

（5）HPLC-ELSD 色谱条件 I ODS 色谱柱 4.6 mm250 mm 大连依利特科学仪器厂 柱温 25 C 流动相 乙腈 - 水 -四氢呋喃 33I67 4 流速 1 ml/min 进 样 量 20 Ul ELSD 参数 漂移管温度 105 氮气 流速 2.82 L/min[15] I Alltech C18柱 250 mm>4.6 mm 5 Um 流动相 乙腈 - 水 38162 流速0.85 ml/min 进样量 20 ul ELSD 参数:漂移管温度 105 C 载气流量 2.5 L/min[16] I ODS 色谱柱 4.6 mm>250 mm 大连依特利科学仪器厂 流动相 乙腈 - 水 36I64 流 速 0.8 ml/min 进样 量 20 Ul ELSD 参 数 漂 移 管 温 度 100 C 氮 气 流 速 2.74ml/min

（6）HPLC- 示差折光检测法 色谱条件 色谱柱为 Hypersil 4.6 mm >200 mm 5 Um 流动相 甲醇 - 水 67 33 流速 1 ml/min 柱温 35 C检测器 ATTEN 4。

4.3.3黄芪多糖的含量测定

（1）微波提取法 取样品 黄芪粉末用 80%的乙醇浸泡过夜 在 MCL-3 型连续微波反应器中用 80%乙醇回流 20 分钟 调整功率 560 W 500 W 400 W 350 W 残渣挥去溶剂后再放入 MCL- 3 型连续微波反应器中 继续用水回流 提取 20 分钟 调整 功 率 630 W 600 W 560 W 450 W 反复洗至250 ml容量瓶中定容 摇匀成为样品液。

（2） 超滤法 称样品 黄芪饮片 [21]加水倍量 分别煮沸 1小时和 40 分钟 分别过滤 合并 2 次滤液 冷藏后 离 心 取 上 清液用空纤维超滤后截留分子量 6 000 D 以上的药液 浓缩至 1：1（1 g 生药相当于 1 ml） 加 3 倍量 95%乙醇沉淀 放置 12 小时以上 离心沉淀蒸干 称重 即一次醇沉后蒸干物 将蒸干物按 1：50 即 1 g 蒸干物溶至 50 ml 蒸馏水中 溶解 放置后离心分别取上清夜加入3倍剂量 95%乙醇沉淀冷藏后离心 沉淀物蒸干即2次醇沉后多糖粗提物。

2.2 测定 常用的测定方法为(苯>酚 - 硫酸比色法:取样品[20](多糖粗提物>至干燥试管中,加水,再分别加入 5%的苯酚溶液,摇匀,然后加浓硫酸,充分摇匀,室温放置 25 分钟。在 400~600 nm 处测定其最大吸收度。

4.3.4黄芪中黄酮的含量测定

以异黄酮 10- 羟基 -3,9- 二甲基紫檀烷为例作简要概述。

(1)提取 精密称取黄芪毛状根粉 5.00 g,置 Soxhlet 提取器中用甲醇 100 ml 提取 2 小时,提取液过滤,将提取液减压蒸去甲醇,用乙酸乙酯分配 3 次,合并乙酸乙酯部分减压蒸干,以重蒸甲醇定容至 2 ml,用 0.45 Um 微孔滤膜过滤,得供试品溶液。

(2) 含量测定:色谱条件 色谱柱:NucleosilC18 柱 (4.6 nm>25nm,5 Lm>,流动 相 为 :甲 醇 - 水 =3I2(V/V>,柱 温为 室 温 ;流速为 0.6 ml/min;检测波长 280 nm[23]。色谱条件 色谱柱:Inertsil ODS-3 (4.6 mm>250mm,5 Um>;流动相:甲醇 - 水(2z1>;检测波长:280 nm;流速:0.8 ml/min;柱温:室温。

小结

综上所述,黄芪的成分较复杂,因此,不能仅以黄芪甲苷作为其质量标准的惟一指标。近些年,对黄芪甲苷的含量测定方法研究较多,在对黄芪甲苷进行含量测定时,因前处理步骤较多,尤其是以碱水及水萃取洗涤,体积不宜过大,因黄芪甲苷分子量较大,必须注意减少损失。而对黄芪多糖~黄酮进行含量测定方法研究并不很多, 希望有更多更好的方法作为评价黄芪质量的综合性指标。

作者：白小平 杜晓红(内蒙古北方重工集团医院,内蒙古 包头 014030)

参考文献

1 中国科学院新疆土壤沙漠研究所.新疆药物植物志[M].第 3 册.新疆人民教育出版社.1984,58~59

2 中华本草编委会. 中华本草 [M]. 上海: 上海科学技术出 版 社.1999,341~356

3 洒丽明.蚂蚁乙肝宁冲剂中黄芪甲苷的薄层扫描定量[J].中成药,1997,19(1>:15~16

4 曹爱民,徐淑卿,赵余庆,等.补阳还五汤制剂中黄芪甲苷的含量测定[J].中成药,1994,16(11>:15~16

5 王旭,周富荣.薄层扫描法测定隆必消胶囊中黄芪甲苷的含量[J].中国中药杂志.1999,24(5>:285~287

6 李玲玲,李敏伶,何金山.复方升白灵中黄芪甲苷的薄层扫描法测定[J].药物分析杂志,1996,16(1>:28~30

7 苏健,王宝琴,王广才.归芪合剂及其主药黄芪的检验方法研究[J].中国中药杂志,1994,19(3>:158~161

8 胡蓓莉,王海涛,等.几种黄芪属植物中生物活性成分的比较研究[J].中成药,1997,19(2>:40~42

5 小结与展望

随着中药现代化进程的加快，对于中药制剂的质量标准建立也是提出了更高的要求。中药类活性成分因为结构复杂和成分的多样性给分析检测带来了巨大的困难，黄芪制剂的皂苷成分的定性和定量亦是如此。为此药学工作者进行了大量深入的研究，采用了西药检测中常用的HPLC法对黄芪制剂皂苷成分进行了测定，并取得了一定的成果，测定结果的准确性更高，操作更为简便。当然HPLC法在检测时也存在着一定问题，例如当黄芪皂苷结构相类似时，可能难以达到组分间的完全分离，给测定结果带来一定的误差，其次在HPLC法定量时，需要有相应的对照品，但是所有成分的对照品的制备难度依然存在，在缺少对照品时很难对皂苷成分进行准确定量。

虽然目前HPLC法用于黄芪制剂皂苷成分的检测还存在一定的问题，但是随着HPLC技术的不断更新升级，以及中药活性成分提取分离技术的提高，HPLC法用于测定黄芪皂苷成分含量会有着良好的应用价值。