山楂中黄酮类化合物的测定方法概述 (7)(三)

山楂中黄酮类化合物的测定方法概述

三、山楂中黄酮类化合物的测定方法和实例

1、分光光度法

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。

根据朗伯(Lambert)-比尔(Beer)定律:A=abc

式中A为吸光度，b为溶液层厚度（cm），c为溶液的浓度（g/dm^3)，a为吸光系数。

王海燕等用荧光分光光度法，在盐酸酸性介质中、无表面活性剂、常温下、铝离子浓度为2×10^-4mol/L时条件下，反应时间30min,槲皮素的浓度范围在0.2×10^-5-1.5×10^-5mol/L之间时,荧光强度（F）和槲皮素浓度（c）呈良好的线性关系;检测限为2.4×10^-8mol/L。

分光光度法设备价廉,操作简单,但因测定的是混合体系的药物含量,未经分离纯化的样品易受其它成分的干扰,测定误差较大,且检测液中一般要加入NaNO2,毒性较大。

2、高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。

章弘扬等采用高效液相色谱-质谱法鉴定了山楂中的绿原酸、原花青素B2、表儿茶素、金丝桃苷、异槲皮苷，采用反相色谱-二极管阵列检测法同时定量测定了其含量。其中所用色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18（250mm4.6mm,5μm）；流动相A:0.3%甲酸水溶液，B:乙腈；用于LC-MS定性分析的梯度为0～40mins（10%B～30%B），用于HPLC定量分析的梯度为0～40mins（5%B～30%B）；流速：0.8mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：280nm，355nm，进样量10μL。LC/MS系统使用ESI离子源，在正、负离子模式下分别采集数据，采用分流设置，分流比约为1:3。检测参数设置如下：脱溶剂气流量600L/min，脱溶剂气温度350℃，锥孔气流量40L/h，离子源温度120℃，毛细管电压2000V（ESI＋）和1800V（ESI－），锥孔电压50V。质谱图平均扫描速率设为0.2s，质量扫描范围100－1600m/z。实验数据采用Masslynx软件处理。

通过LC/MS鉴定出8种可能的黄酮类成分。对其中5种黄酮成分的定量方法学进行验证，绿原酸、原花青素B2、表儿茶素、金丝桃苷、异槲皮苷的线性分别为1.8-178.5,2.2-284.8,2.7-270.6，1.5-150.0,1.5-150.0μg·mL-1，相关系数均高于0.999；精密度、重复性的RSD均小于5.0%；平均回收率为98.5%-102.5%，RSD小于3.5%。

高效液相色谱法无疑是使用最多,也是准确度最为可靠的分析方法。该法重复性好，且简便、可靠，可为山楂质量控制标准的建立提供了科学依据。但是分析时间相对长且仪器比较昂贵,色谱柱易被污染而且污染后难于清洗,使柱的使用寿命缩短,在工业中不易推广

3、高效毛细管电泳法

高效毛细管电泳（HPCE）是今年来发展迅猛的一种新型分离技术。分析时间短，分离效率高，适应性广，检测线低，进样量小，溶剂消耗少，自动化程度高。山楂中的黄酮类化合物极性较弱选用MECC模式作为HPCE分离模式对山楂中的黄酮类化合物HPCE方法学实验。

张君仁就此种方法对山楂中的黄酮类化合物进行了研究。运用15%甲醇为有机添加剂，5mmol/L阴离子添加剂，214nm波长，23℃室温，30KV分离电压硼酸盐为缓冲系统，进样压0.5-0.6MPa,时间2秒。最后进行线性考擦后，其线性范围为：0.05-0.25mg/mL,加标回收实验得出，金丝桃甙的回收率为106.7%，其RSD为1.61%(n=6)；牡荆素鼠李糖甙的回收率为105%，其RSD为2.95%(n=6)。

参考文献

【1】李建华，胡金林.山楂的药理作用与临床应用【J】.中国药物滥用防治杂志，2011,17（7）：334

【2】中国科学院北京植物研究所.中国植物志36卷【M】.北京：科学出版社，1974:189

【3】张妍，李厚伟，张永春，等.山楂中总黄酮几种提取分离方法的考擦及含量测定【J】.哈尔滨医科大学，2001,35（3）：183

【4】章弘扬，张弛，王月荣，等.山楂中黄酮类成分的定性和定量分析[J].中国中药杂志，2012，37（5）：601-605. 

【5】王海燕,贾宝秀,臧晴晴.荧光分光光度法测定大山楂丸中黄酮类化合物的含量[J].中国医院用药评价与分析,2014,,8:695-697

【6】   张君仁，徐雁玲.高效毛细管电泳分离测定银杏叶及山楂叶中黄酮类化合物的研究[].硕士学位论文，2002：37